Zbiory muzeum są bardzo różnorodne. Obejmują nie tylko sztukę sakralną, ale także przedmioty z różnych innych działów sztuki, między innymi zabytki archeologiczne, portrety osób duchownych i świeckich od XVII wieku, grafikę i exlibrisy, numizmaty oraz tkaniny. Większość posiadanych eksponatów trafiła do muzeum jako dary przekazane przez parafie z terenu diecezji oraz osoby prywatne.
Zbiory obejmują cenne przykłady polskiej sztuki cechowej, zazwyczaj fragmenty pozostałe z XV-wiecznych tryptyków i malarstwa z początku XVI wieku. Najcenniejsze z nich to boczne skrzydła tryptyku z Żurowej z przedstawieniem sceny Zwiastowania NMP (ok. 1470), tryptyk z Osieka Jasielskiego ze scenami z życia apostołów Piotra i Pawła (1527), czy panel z przedstawieniem Matki Bożej w typie Hodegetrii z warsztatów Małopolskich (1460). Zbiory muzealne posiadają też obrazy z okresu XVII i XVIII wieku, głównie przedstawiające sceny z życia Jezusa, Maryi i świętych. Wśród tej kolekcji mieści się też malarstwo portretowe, obejmujące okres od schyłku renesansu do rozwiniętego baroku, przedstawiające magnaterię i duchowieństwo. Wśród ciekawszych przykładów warto zwrócić uwagę na portret biskupa przemyskiego Pawła Piaseckiego (1644-1649) z panoramą siedemnastowiecznego Przemyśla, portret biskupa przemyskiego Aleksandra Antoniego Fredry (1724-1734), z wymalowanymi bryłami trzech kościołów: w Jarosławiu, Starej Wsi oraz przebudowanej katedry w Przemyślu, i najbardziej okazały obraz z kościoła w Dubiecku, namalowany przez Mikołaja Tereińskiego (ok. 1753), przedstawiający rodzinę Krasickich. Wśród tych zbiorów malarskich znajdują się także sarmackie portrety trumienne.
W zbiorach Muzeum znajduje się kolekcja ikon pochodzących z terenów Ziemi Przemyskiej i Łemkowszczyzny. Godna uwagi jest najstarsza w zbiorach, pochodząca z XVI wieku ikona Matki Bożej Hodegetrii z prorokami. Pośród zabytków z XVII wieku warto wspomnieć o ikonach Chrystusa Pantokratora z Odrzechowej, Madylionu i Trójcy Świętej. Bogata w treści teologiczne jest ikona Zaśnięcia Matki Bożej z przełomu XVII i XVIII wieku. Ciekawe są ikony z tzw. warsztatów rybotyckich z przełomu XVII-XVIII wieku. Oprócz ikon dawnych w kolekcji znajdują się też ikony z przełomu XIX/XX wieku, a pośród nich autorstwa Josipa Kuryłasa i Juliana Pańkiewicza, kształcących się w Akademii Krakowskiej.
Kolekcja działu graficznego jest dość pokaźna. Najstarsze zabytki pochodzą z XV i XVI wieku i są to głównie drzeworyty. Wśród nich godne uwagi są sztychy autorstwa Albrechta Dürera i Martina Schongauera. Muzeum posiada kolekcję miedziorytów z XVII i XVIII wieku, pochodzących z Anglii, Francji, Italii, Niemiec i Niderlandów. Wśród ważniejszych autorów grafik znajdujemy: Hieronima Wierixa, Lukasa Kiliana, Henricusa Goltziusa, Cornelisa Galle, Philipa Galle, Adrieana i Joannesa Collaertów oraz Johannesa Klaubera. W kolekcji grafik znajdują się też akwaforty, staloryty i litografie z XIX i XX wieku.
Rzeźbę sakralną reprezentują głównie przedstawienia Matki Bożej z Dzieciątkiem, jak na przykład ze Święcan (XIV w.) oraz z grupy Świętej Anny Samotrzeć. Z 1520 roku pochodzą rzeźby wchodzące w skład belki tęczowej w drewnianych kościołach w Kosinie i Święcanach. Ciekawym przykładem rzeźby ludowej jest figura św. Floriana (XVII w.). Zbiory rzeźb zawierają kolekcję krucyfiksów ukazujących studium ikonograficzne obrazujące kształtowanie się przedstawień tego typu. Wśród przedstawień Ukrzyżowanego interesującym eksponatem jest monumentalny krucyfiks z Nowego Miasta (XV/XVI w). Do cenniejszych rzeźb figuralnych z okresu baroku należą przedstawienia aniołów dłuta Tomasza Huttera oraz dwaj nieznani z imienia święci ze szkoły lwowskiej.
W muzealnych zasobach rzemiosła artystycznego znajdujemy drewniane polichromowane sakrarium do przechowywania Najświętszego Sakramentu z XV wieku, czy renesansową szafkę do przechowywania monstrancji (1562). Do kolekcji tej należą też różne naczynia liturgiczne, wśród których warty uwagi jest srebrny kielich z rytowaną dekoracją na stopie z 1510 roku, srebrny kielich barokowy z 1625 roku, czy kielich z augsburskiego warsztatu mistrza Jana Jakuba Krehna, z motywem liści suchego akantu (1700). Do tego zbioru należy miedziana monstrancja ze śladami złocenia pochodząca ze Skalnika (XV w.). Muzeum eksponuje również rzadkie przykłady gotyckich kadzielnic z brązu: ze Skalnika i z Reczpola (XV w.). Zupełną rzadkością jest kolekcja cynowych i drewnianych kielichów mszalnych i monstrancji z okresu „józefinizmu” (XVIII/XIX w.). Godna uwagi zwiedzających jest również bogata kolekcja relikwiarzy o różnych wymiarach i kształtach.
Jest to najliczniej reprezentowany dział muzeum obejmujący głównie szaty liturgiczne. Najstarsze z nich pochodzą z drugiej połowy XIV wieku. Są to dwa fragmenty haftowanych pretekst z ornatów: z przedstawieniem św. Jakuba (1390) i Matki Bożej Apokaliptycznej (1380). Późniejsze hafty należą już do drugiej połowy XV wieku. Pośród nich występuje preteksta krzyżowa ze sceną Zaśnięcia Matki Boskiej w otoczeniu apostołów, wykonana haftem reliefowym, posiadająca analogie z haftami wykonywanymi w ośrodku krakowskim.
Muzeum posiada w swojej kolekcji aksamity tureckie zdobyte podczas Odsieczy Wiedeńskiej (1683) z których wykonano kapy i ornaty. Z XVIII-wiecznych tkanin godne uwagi są tapiserie, przedstawiające czterech Ewangelistów według wzorów Guido Reniego (1575-1642), powstałe w warsztatach papieskich San Michele, a sprowadzone z Rzymu przez biskupa Aleksandra A. Fredrę (1724-1734). Do tapiserii należą też dwa ornaty z Bieździatki (XVIII w.) ze sceną Ukrzyżowania i motywami kwiatowymi, gdzie działała założona około 1760 roku niewielka manufaktura Romerów.
Muzeum przez lata zgromadziło kilkaset pamiątek po Ojcu Świętym Janie Pawle II. Wśród nich są jego osobiste rzeczy: szkaplerz, sutanna papieska, biała piuska, półbuty z czerwonej skóry, laska, plecak turystyczny, z którym w latach 1967-1978 przemierzał szlaki Beskidu Niskiego, pokrowiec na materac, a nawet laska używana w 1997 roku podczas wizyty w Dukli i Krośnie. Część tych eksponatów, jak i wiele innych pamiątek, przekazał muzeum abp Józef Michalik, były Metropolita Przemyski, który podczas wielokrotnych odwiedzin w Watykanie otrzymywał je od św. Jana Pawła II. W tym zbiorze znajduje się duża kolekcja numizmatów: kilkaset medali i monet, wybijanych podczas pontyfikatu Jana Pawła II pochodzących z Watykanu i całego świata. Ubogaceniem kolekcji papieskiej jest także kolekcja ofiarowana muzeum przez pana Stanisława Kusińskiego, który przekazał również swoje zbiory filatelistyczne i biblioteczne.